Născut la 6 decembrie 1833, în județul Powhatan, VA, John Singleton Mosby era fiul lui Alfred și al lui Virginny Mosby. La vârsta de șapte ani, Mosby și familia sa s-au mutat în județul Albemarle, lângă Charlottesville. Educat la nivel local, Mosby a fost un copil mic și a fost adesea ales, cu toate că rareori s-a întors dintr-o luptă. Intrând în 1849 la Universitatea din Virginia, Mosby s-a dovedit a fi un student capabil și a excelat la latină și greacă. În timp ce era student, s-a implicat într-o luptă cu un bătăuș local, timp în care l-a împușcat pe bărbat în gât.
Expulzat din școală, Mosby a fost condamnat pentru împușcare ilegală și condamnat la șase luni de închisoare și o amendă de 1.000 de dolari. În urma procesului, mai mulți dintre jurați au solicitat eliberarea lui Mosby, iar la 23 decembrie 1853, guvernatorul a emis o grațiere. În timpul scurtului său timp în închisoare, Mosby s-a împrietenit cu procurorul local, William J. Robertson, și a indicat interesul pentru studierea dreptului. Citind legea la biroul lui Robertson, Mosby a fost în sfârșit admis la bar și și-a deschis propria practică în apropierea Howardsville, VA. La scurt timp după aceea, a cunoscut-o pe Pauline Clarke, iar cei doi s-au căsătorit la 30 decembrie 1857.
Cu sediul în Bristol, VA, cuplul a avut doi copii înainte de izbucnirea războiului civil. Inițial adversar al secesiunii, Mosby s-a înscris imediat în Rifles Mounted Rifles (prima cavalerie Virginia) când statul său a părăsit Uniunea. Luptând ca particular la prima bătălie de la Bull Run, Mosby a constatat că disciplina militară și soldatul tradițional nu erau pe placul lui. În ciuda acestui fapt, el s-a dovedit un cavaler capabil și a fost în curând promovat la primul locotenent și a devenit adjutant al regimentului.
Pe măsură ce luptele s-au deplasat în Peninsula în vara anului 1862, Mosby s-a oferit voluntar pentru a servi ca cerceta generalului de brigadă J.E.B. Faimoasa plimbare a lui Stuart în jurul armatei Potomacului. În urma acestei campanii dramatice, Mosby a fost capturat de trupele Uniunii la 19 iulie 1862, în apropiere de gara Beaver. Luat la Washington, Mosby a observat cu atenție împrejurimile sale în timp ce a fost mutat pe Hampton Roads pentru a fi schimbat. Observând navele care comandă generalul maior Ambrose Burnside care sosesc din Carolina de Nord, el a raportat imediat aceste informații generalului Robert E. Lee, după ce a fost eliberat.
Această informație a ajutat-o pe Lee în planificarea campaniei care a culminat cu cea de-a doua bătălie de la Bull Run. În toamna aceea, Mosby a început să facă lobby pe Stuart pentru a-i permite să creeze o comandă independentă de cavalerie în Virginia de Nord. Funcționând în conformitate cu Legea privind riscul de partizani a Confederației, această unitate va efectua mici raiduri rapide, pe liniile de comunicare și furnizare ale Uniunii. Căutând să-l imite pe eroul său din Revoluția americană, liderul partizan Francis Marion (Fox Swamp), Mosby a primit în cele din urmă permisiunea de la Stuart în decembrie 1862 și a fost promovat la marea în martie următoare..
Recrutându-se în Virginia de Nord, Mosby a creat o forță de trupe neregulate care au fost desemnate rangerii partizani. Constând din voluntari din toate punctele de viață, aceștia locuiau în zonă, îmbinându-se cu populația și s-au reunit când au fost chemați de comandantul lor. Conducând atacuri de noapte împotriva avanposturilor din Uniune și aprovizionând convoiul, au lovit acolo unde inamicul era cel mai slab. Deși forța lui a crescut în dimensiuni (240 până în 1864), aceasta a fost rareori combinată și a atins deseori mai multe ținte în aceeași noapte. Această dispersie a forțelor i-a ținut pe cei care urmăreau unirea lui Mosby din echilibru.
La 8 martie 1863, Mosby și 29 de bărbați au atacat la Curtea Județeană de la Fairfax și l-au capturat pe generalul de brigadă Edwin H. Stoughton în timp ce dormea. Alte misiuni îndrăznețe au inclus atacuri asupra stației Catlett și Aldie. În iunie 1863, comanda lui Mosby a fost redesenată al 43-lea batalion al Rangerilor Partizani. Deși urmărită de forțele Uniunii, natura unității lui Mosby le-a permis bărbaților săi pur și simplu să se estompeze după fiecare atac, lăsând nicio urmă de urmat. Frustrat de succesele lui Mosby, locotenentul general Ulysses S. Grant a emis un edict în 1864, potrivit căruia Mosby și bărbații săi urmau să fie desemnați haiduși și atârnați fără proces dacă sunt prinși.
Pe măsură ce forțele Uniunii sub controlul generalului general Philip Sheridan s-au mutat în Valea Shenandoah în septembrie 1864, Mosby a început să funcționeze pe spate. Mai târziu în acea lună, șapte dintre oamenii lui Mosby au fost prinși și spânzurați la Front Royal, VA, de generalul de brigadă George A. Custer. În represalii, Mosby a răspuns în natură, ucigând cinci prizonieri din Uniune (alți doi au scăpat). Un triumf cheie a avut loc în octombrie, când Mosby a reușit să surprindă salariile lui Sheridan în timpul „Raidului Greenback”. Pe măsură ce situația din Valea se escalada, Mosby i-a scris lui Sheridan la 11 noiembrie 1864, solicitând revenirea la tratamentul echitabil al prizonierilor..
Sheridan a fost de acord cu această solicitare și nu au mai fost ucise. Frustrat de atacurile lui Mosby, Sheridan a organizat o unitate specializată de 100 de bărbați pentru a captura partizanul confederat. Acest grup, cu excepția a doi bărbați, a fost ucis sau capturat de Mosby pe 18 noiembrie. Mosby, promovat în colonel în decembrie, și-a văzut comanda ridicându-se la 800 de bărbați și și-a continuat activitățile până la sfârșitul războiului din aprilie 1865. Nevoind să se predea în mod oficial, Mosby și-a revizuit bărbații pentru ultima dată pe 21 aprilie 1865, înainte de a-și desființa unitatea.
În urma războiului, Mosby a înfuriat mulți în sud devenind republican. Crezând că a fost cel mai bun mod de a ajuta la vindecarea națiunii, a făcut prietenie cu Grant și a ocupat funcția de președinte al campaniei prezidențiale din Virginia. Ca răspuns la acțiunile lui Mosby, fostul partizan a primit amenințări cu moartea și a avut casa arsă de copilărie. În plus, cel puțin o încercare a fost făcută în viața sa. Pentru a-l proteja de aceste pericole, Grant l-a numit consul al SUA în Hong Kong în 1878. Revenind în SUA în 1885, Mosby a lucrat ca avocat în California pentru calea ferată din Pacificul de Sud, înainte de a trece printr-o varietate de posturi guvernamentale. Ultima funcție de procuror general adjunct în Departamentul Justiției (1904-1910), Mosby a murit la Washington DC la 30 mai 1916 și a fost înmormântat la Cimitirul Warrenton din Virginia.