Procedura Gram Stain in Microbiologie

Colorația Gram este o metodă diferențiată de colorare folosită pentru atribuirea bacteriilor la una dintre cele două grupuri (gram-pozitive și gram-negative) bazată pe proprietățile pereților lor celulari. Este, de asemenea, cunoscut sub numele de Gram colorare sau metoda Gram. Procedura este numită pentru persoana care a dezvoltat această tehnică, bacteriologul danez Hans Christian Gram.

Cum funcționează Stain Gram

Procedura se bazează pe reacția dintre peptidoglican în pereții celulari ai unor bacterii. Pata Gram presupune colorarea bacteriilor, fixarea culorii cu un mordant, decolorarea celulelor și aplicarea unui contrasens.

1. Pata primară (cristal violet) se leagă de peptidoglican, celulele colorante violet. Atât celulele gram-pozitive, cât și cele gram-negative au peptidoglican în pereții lor celulari, așa că inițial, toate bacteriile colora violet.
2. Iodul Gram (iod și iodură de potasiu) se aplică ca mordant sau fixativ. Celulele gram-pozitive formează un complex de cristal violet-iod.
3. Alcoolul sau acetona sunt utilizate pentru decolorarea celulelor. Bacteriile gram-negative au peptidoglican mult mai puțin în pereții lor celulari, astfel încât acest pas le face în esență incolore, în timp ce doar o parte din culoare este îndepărtată din celulele gram-pozitive, care au mai mult peptidoglican (60-90% din peretele celular). Peretele celular gros al celulelor gram pozitive este deshidratat prin etapa de decolorare, determinându-le să se micșoreze și să capteze complexul de pete-iod din interior.
4. După etapa de decolorizare, se aplică un conținut (de obicei safranină, dar uneori fuchsine) pentru a colora bacteriile roz. Atât bacteriile gram-pozitive, cât și cele gram-negative captează pata roz, dar nu este vizibilă pe violetul mai închis al bacteriilor gram pozitive. Dacă procedura de colorare este efectuată corect, bacteriile gram-pozitive vor fi purpurii, în timp ce bacteriile gram-negative vor fi roz.

Scopul tehnicii de colorare a gramului

Rezultatele petei Gram sunt vizualizate folosind o microscopie ușoară. Deoarece bacteriile sunt colorate, nu numai că este identificată grupa lor de colorare Gram, dar poate fi observată forma, mărimea și modelul de aglomerare. Acest lucru face ca pata Gram să fie un instrument valoros de diagnostic pentru o clinică sau laborator medical. În timp ce pata poate să nu identifice cu siguranță bacteriile, de multe ori știind dacă sunt gram-pozitive sau gram-negative este suficient pentru a prescrie un antibiotic eficient.

Limitările tehnicii

Unele bacterii pot fi variabile gram sau gram-nedeterminate. Cu toate acestea, chiar și aceste informații pot fi utile în reducerea identității bacteriene. Tehnica este cea mai fiabilă atunci când culturile au o vechime mai mică de 24 de ore. Deși poate fi folosit pe culturi de bulion, este mai bine să le centrifugați mai întâi. Limitarea principală a tehnicii este aceea că dă rezultate eronate dacă se fac greșeli în tehnică. Practica și abilitatea sunt necesare pentru a produce un rezultat fiabil. De asemenea, este posibil ca un agent infecțios să nu fie bacterian. Agenții patogeni eucarioti colorați gram-negativi. Cu toate acestea, majoritatea celulelor eucariote cu excepția ciupercilor (inclusiv a drojdiei) nu reușesc să se lipească de diapozitiv în timpul procesului.

Procedura de colorare a gramului

materiale

• Violet de cristal (pată primară)
• Iodul Gram (mordant, pentru a fixa violetul de cristal în peretele celular)
• Etanol sau acetonă (decolorizant)
• Safranin (pata secundară sau reținere)
• Apa într-o sticlă de sticlă sau sticlă cu picătură
• Diapozitive la microscop
• Microscop compus

paşi

1. Puneți o picătură mică de probă bacteriană pe o lamelă. Căldura fixează bacteriile pe diapozitiv trecând-o prin flacăra unui arzător Bunsen de trei ori. Aplicarea prea multă căldură sau prea mult timp poate topi pereții celulelor bacteriilor, distorsionând forma lor și conducând la un rezultat inexact. Dacă se aplică prea puțină căldură, bacteriile se vor spăla pe diapozitiv în timpul colorației.
2. Utilizați un picurător pentru a aplica pata primară (violet de cristal) pe lamelă și lăsați-o să stea 1 minut. Clătiți ușor diapozitivul cu apă nu mai mult de 5 secunde pentru a îndepărta excesul de pată. Clătirea prea lungă poate îndepărta prea multă culoare, în timp ce nu se clătește suficient de mult poate permite să rămână prea multă pată pe celulele gram-negative.
3. Utilizați un picurător pentru a aplica iodul Gram pe lamelă pentru a fixa violetul de cristal pe peretele celulei. Lasă-l să stea 1 minut.
4. Clătiți lamela cu alcool sau acetonă aproximativ 3 secunde, urmată imediat cu o clătire blândă cu apă. Celulele gram-negative își vor pierde culoarea, în timp ce celulele gram pozitive vor rămâne violete sau albastre. Cu toate acestea, dacă decolorul se lasă prea mult timp, toate celulele își vor pierde culoarea!
5. Aplicați pata secundară, safranina și lăsați-o să stea 1 minut. Clătiți ușor cu apă nu mai mult de 5 secunde. Celulele gram-negative ar trebui să fie colorate în roșu sau roz, în timp ce celulele gram-pozitive vor apărea în continuare violet sau albastru.
6. Vizualizați diapozitivul folosind un microscop compus. Poate fi necesară o mărire de la 500x la 1000x pentru a distinge forma și aranjarea celulelor.

Exemple de patogeni gram-pozitivi și gram-negativi

Nu toate bacteriile identificate de colorația Gram sunt asociate cu boli, dar câteva exemple importante includ:

• Cocci gram pozitivi (rotunzi): Staphylococcus aureus
• Cocci gram-negativi: Neisseria meningitidis
• Bacili gram pozitivi (tije): Bacillus anthracis
• Bacili gram-negativi: Escherichia coli